如何解析对比基因组工具hisat2
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由于测序仪机器读长的限制,在构建文库的过程中首先需要将DNA片段化,测序得到的序列只是基因组上的部分序列。为了确定测序reads在基因组上的位置,需要将reads比对回参考基因组上,这个步骤叫做mapping。
在进行mapping时,需要考虑以下几个因素
1. 硬件资源的消耗
通常来说,基因组越大,占用的内存越大。对于大型基因组,比如人类基因组而言,优化内存消耗是很关键的一点。
2. 运行速度
随着测序价格的下降和数据深入挖掘的需求,测序量越来越大,海量测序reads的比对,要求速度上必须够快。
3. 准确性
SNP/indel, 测序错误率等因素都使得测序的reads和基因组上的原始序列会存在几个bp的误差,所以mapping的算法必须支持碱基的错配,或者是gap的存在。同时由于测序的短序列可能和基因组多个位置存在同源,一条reads会比对到基因组上多个位置。双端测序技术在一定程度上能够校正多个位置,因为双端reads 来自同一个DNA片段,二者在基因组上的位置不会相距太远,但是仅靠这一点并不能解决所有的同源比对,这就要求比对算法对多个位置进行判断和打分,给出比对结果的可靠性。
4. RNA
对于转录组数据, 真核生物可变剪切的存在,导致cdnA片段在基因组上的位置并不是连续的,中间可能存在内含子。在比对转录组数据时,就需要考虑跳过剪切位点。
目前mapping的工具有很多,比如bwa, hisat, star等。hisat 是其中速度最快的,是tophat软件的升级版本。采用了改进的FM index 算法,对于人类基因组,只需要4.3GB左右的内存。同时支持DNA和RNA数据的比对,软件官网如下
http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
目前最新版为为hisat2. 安装过程如下
wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip unzip hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
下载解压缩即可。
在进行比对前,首先需要对参考基因组建立索引, 基本用法如下
hisat2-build -p 20 hg19.fa hg19
对于转录组数据,在构建索引时,可以通过gtf
文件,得到剪切位点和exon的信息,用法如下
hisat2_extract_splice_sites.py hg19.gtf > hg19.ss hisat2_extract_exons.py hg19.gtf > hg19.exon hisat2-build -p 20 --ss hg19.ss --exon hg19.exon hg19.fa hg19
hisat2 支持多种格式的输入文件,常见格式有以下两种
fasta
fastq
-f
参数表示输入问下格式为fasta, -q
参数表示输入文件格式为fastq。输入文件可以是经过gzip压缩之后的文件,默认输入文件是fastq格式。
对于单端数据,采用-U
指定输入文件;对于双端数据,采用-1
和-2
分别指定R1端和R2端的输入文件。
reads比对到基因组上的一个位置,我们称之为一个alignment。 软件会对所有的alignments 进行打分和判断,能够符合过滤条件的alignment 称之为valid alignment, 只有valid alignments , 才会输出。
和blast类似,每个alignment也有对应的打分机制。hisat 从以下几个方面对alignment 进行打分
1. 错配碱基罚分
错配碱基的罚分通过--mp
参数指定,其值为逗号分隔的两个数字,第一个数字为最大的罚分,第二个数字为最小的罚分
2. reads上的gap罚分
gap的罚分通过分成两个部分,第一次出现gap的罚分和gap延伸的罚分,reads上的gap罚分通过--rdg
参数指定,其值为逗号分隔的两个数字,第一个数字为gap第一个位置的罚分,第二个数字为gap延伸的罚分。
3. reference上的gap罚分
reference上的gap罚分通过--rdg
参数指定,其值为逗号分隔的两个数字,第一个数字为gap第一个位置的罚分,第二个数字为gap延伸的罚分。
经过一系列的罚分机制,每个alignment会有一个对应的得分,然后会根据一个阈值,来判断这个得分是否满足valid alignment的要求。
hisat通过--score--min
参数指定该阈值,指定方式是一个和reads程度相关的函数,默认值为L,0,-0.2, 对应函数为
f(x) = 0 - 0.2 * x
根据reads长度,可以计算出得分的阈值,大于该阈值的alignment 被认为是valid alignment , 才可能被输出。L
代表线性函数,此外,也支持其他类型的函数,比如常量,自然对数等,更多选择请参考官方文档。
一条reads可能会拥有多个valid alignments, 在输出时,并不会输出所有的alignments, 而是只输出-k
参数指定的N个alignments,-k
参数的默认值为5。
输出结果以SAM格式保存,默认输出到屏幕上,可以通过-S
参数指定输出文件。
通常情况下,默认参数就能够满足我们的需求了。单端数据比对的用法如下
hisat -x hg19 -p 20 -U reads.fq -S align.sam
双端数据用法如下
hisat -x hg19 -p 20 -1 R1.fq -2 R2.fq -S align.sam
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文章标题:如何解析对比基因组工具hisat2
文章来源:http://myzitong.com/article/ggcicd.html