怎么使用ballgown进行转录本水平的差异分析

这期内容当中小编将会给大家带来有关怎么使用ballgown进行转录本水平的差异分析,文章内容丰富且以专业的角度为大家分析和叙述,阅读完这篇文章希望大家可以有所收获。

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常见的转录组差异分析有两种策略,一种是基于raw count的定量方式,比如DESeq2, edgeR等;另外一种是基于FPKM/RPKM的定量方式,比如cuffdiff等。

在之前的文章中,我们也提到过基于FPKM值的pipeline由tophat+cufflinks+cuffdiff 升级更新为hisat + stringTie + ballgown。ballgown这个R包也是针对FPKM值的表达量进行差异分析,有两种方式可以得到转录本水平的FPKM值。

1. stringTie

为了方便下游的ballgown分析,在stringTie软件中直接添加-b参数就可以生成ballgown的输入文件,基本用法如下

stringtie -p 10 \
-G hg19.gtf \
-o output.gtf  \
-b ballgown_out_dir -e \
align.sorted.bam
2. tablemaker

tablemaker软件通过调用cufflinks软件,也可以生成ballgown的输入文件,该软件可以从以下链接下载

https://figshare.com/articles/Tablemaker_Linux_Binary/1053137

基本用法如下

tablemaker \
-p 4 \
-q -W \
-G hg19.gtf \
-o out_dir \
align.sorted.bam

对于每个样本,都会生成一个文件夹,包含如下5个文件

e_data.ctab
e2t.ctab
i2t.ctab
i_data.ctab
t_data.ctab

e代表exon, i代表intron, t代表transcript_data的文件为不同水平的表达量值。i2t表示intron和transcript之间的对应关系,e2t表示exon和transcript的对应关系。

输入文件准备好之后,就可以进行差异分析了。现在的R包都是高度封装的,几个函数就可以完成整套分析了。首先是读取所有样本的输入文件,代码如下

library(ballgown)
bg = ballgown(
  samples = c("sampleA.dir", "sampleB.dir"),
  meas='all')

samples 指定所有样本的ballgown的输入文件夹。导入成功之后,可以通过*expr函数在R中查看样本在不同水平的表达量信息, *的取值范围为i, e, tg,代表不同水平。

查看转录本水平的表达量的代码示例如下

transcript_fpkm = texpr(bg, 'FPKM')

需要注意的是,intron, exon, transcript 这些水平的表达量信息在原本的ctab文件中都有,而gene水平的表达量信息,需要根据基因对应的转录本的表达量来计算,所以比较费时。

读取之后,需要设置样本分组, 代码如下

pData(bg) <- data.frame(
  id=sampleNames(bg),
  group=rep(c(1,0), each=3)
)

其实就是一个数据框,第一列为样本名称,第二列为样本对应的分组。

ballgown会自动根据group的种类进行不同类型的差异分析,如果样本分为两组,则进行两组间的差异分析,如果样本为多组,则进行多组间的差异分析。

ballgown通过stattest函数进行差异分析,支持以下4种水平的差异分析

  1. exon

  2. intron

  3. gene

  4. transcript

通过feature参数指定差异分析的水平。常规用法如下

# 转录本水平的差异分析
stat_results = stattest(bg,
  feature='transcript',
  meas='FPKM',
  covariate='group')

# 基因水平的差异分析
stat_results = stattest(bg,
  feature='gene',
  meas='FPKM',
  covariate='group')

ballgown还支持时间序列的差异分析,用法如下

pData(bg) <- data.frame(
  pData(bg),
  time=rep(1:10, 2)
)

results <- stattest(bg,
  feature='transcript',
  meas='FPKM',
  covariate='time',
  timecourse=TRUE
)

只需要添加timecourse=TRUE即可。ballgown还支持自定义差异分析的模型。

上述就是小编为大家分享的怎么使用ballgown进行转录本水平的差异分析了,如果刚好有类似的疑惑,不妨参照上述分析进行理解。如果想知道更多相关知识,欢迎关注创新互联行业资讯频道。


文章标题:怎么使用ballgown进行转录本水平的差异分析
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